Окраска капсул Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой.
Капсула - муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, является производным наружного слоя оболочки. Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) (рис. 5). Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила:
а) мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется;
б) фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метохромотические краски, то есть при использовании которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула - в другой;
в) промывать мазок водой следует слабо и кратковременно.
Рис.5.Капсула у бактерий:
а -
бацилла сибирской язвы; б – диплококкТехника окраска капсул по методу Ольта
Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина наносят на фиксированный мазок, окрашивают 5-7 минут.
Быстро промывают водой и высушивают.
Тело клетки окрашивается в красно-кирпичный цвет, капсула в - желто-оранжевый.
Определение подвижности бактерий Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием
жгутиков -
специальных тонких нитевидных образований. Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии.
Рис. 6. Типы расположения жгутиков у бактерий
В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют(рис. 7):
а)
монотрихи - микроорганизмы имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас);
б)
лофотрихи - микробы имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии);
в)
амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки;
г)
перитрихи - микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(
E.coli).
Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.
Для определении подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться.
Определение подвижности микроорганизмовОпределение подвижности бактерий методом «висячая капля» Каплю молодой (18-20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой (рис. 8). Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые.
Определение подвижности бактерий методом Шукевича Для этого каплю микробной взвеси наносят в конденсат скошенной плотной питательной среды в пробирке. Подвижные микроорганизмы, передвигаясь из конденсата, растут на поверхности среды; неподвижные виды размножаются только в конденсате среды («не заходя» на поверхность агара).
Рис. 7. Исследование микробов на подвижность
а стекло с луночкой; б «висячая капля».Определение подвижности бактерий методом «раздавленная капля» Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят так же как и в методе «висячая капля».
Определение подвижности бактерий методом посева уколом в полужидкий агар Для этого бактериологической
петлей производят посев исследуемой культуры уколом до дна пробирки с полужидкой питательной средой. Подвижная культура растет по всей питательной среде, образуя равномерное помутнение, а неподвижная - только по уколу в виде стержня, сохраняя прозрачность незасеянного участка среды.
Задание для выполнения на занятии
Законспектировать раздел «Техника приготовления мазков» в рабочей тетради.
Законспектировать раздел «Высушивание и фиксирование мазков» в рабочей тетради.
Законспектировать раздел «Техника окраски простым методом» в рабочей тетради. Приготовить из предложенных культур микроорганизмов мазок и окрасить простым методом окраски микроорганизмов Увиденную в поле микроскопа картину зарисовать в рабочей тетради, используя цветные карандаши.
Законспектировать раздел «Техника окраски сложными методами» в рабочей тетради. Приготовить мазки из предложенных культур и окрасить и окрасить их по Граму, по Цилю-Нильсену, по Трухильо и по Ольту. Увиденную в поле микроскопа картину зарисовать в рабочей тетради, используя цветные карандаши.
Законспектировать раздел «Определение подвижности бактерий» в рабочей тетради. Зарисовать в рабочей тетради типы расположения жгутиков у бактерий. Освоить методики определения подвижности микроорганизмов.
Контрольные вопросы
Какова техника приготовления мазков из различного исследуемого материала?
Опишите методику «Техника окраски простым методом».
Каковы методики окраски микроорганизмов сложными методами окраски?
В чем сущность окраски по Граму?
Как определяют подвижность микроорганизмов?
Домашнее задание
Изучить порядок проведения посева и пересева микроорганизмов. Сделать конспект в рабочей тетради.
Подробно изучить и записать в тетради методы получения накопительных культур. Зарисовать в тетради рис.9.
Внимательно изучить и записать в тетради методы выделения чистых культур культур.
Рис. 9. Посев микроорганизмов на поверхность плотной среды в чашках Петри:
а — шпатель Дригальского;
б — положение чашки и рук при посеве шпателем;
в — рост микроорганизмов после рассева шпателем; г — рост микроорганизмов после рассева петлей
Лабораторно-практическое занятие №3Изучение морфологии бактерийЦель занятия. Изучить и описать колонии бактерий, выросших на агаризованной среде, величину, край профиль колоний; приготовить препараты бактерий, определить форму клеток, подвижность, наличие спор; пересеять изучаемые культуры на скошенный агар в пробирку.
Материалы и оборудование. Микроскопы биологические, спиртовки, предметные стекла, бактериалные петли, фуксин Циля, капельница с водой. Чашки Петри с колониями бактерий, пробирки с МПА по 10 мл (скошенный агар).
Методические указания. После объяснений преподавателя студенты конспектируют материал занятия и осваивают нижеизложенные методики, выполняя задания в соответствии с разделом «Задание для выполнения на занятии».
Термин «бактерии» происходит от лат.
bacterion — палка, палочка. Бактерии относятся к прокариотным организмам. Это одноклеточные организмы. Размножение клеток осуществляется путем их роста и деления (обычно пополам, иногда на неравные части).
Клетки после деления могут оставаться соединенными, в результате чего возникают характерные группировки. Многие виды обладают жгутиками бактериального типа и в жидкой среде способны активно плавать; другим свойственно скользящее, сократительное, «щелкающее» или кувыркающееся движение на поверхности твердых сред. У одних видов образуются эндоспоры.
Клетки находятся внутри жесткой или полужесткой клеточной стенки, обеспечивающей постоянство формы.
Генофор бактерий состоит из нуклеоплазмы, которая не отделена от цитоплазмы ядерной мембраной.
В настоящее время принята классификация бактерий, утвержденная юридической комиссией Международного союза микробиологических обществ, представленная в Кратком определителе бактерий Берги. Царство
Procaryotae, к которому относятся бактерии, состоит из двух отделов: первый — фототрофные прокариоты («фотобактерии»), которые здесь не рассматриваются, и второй — прокариоты, индифферентные к свету («скотобактерии»).
Методика выполнения лабораторной работы 1
. Изучить и описать колонии бактерий, выращенных на плотной питательной среде в чашках Петри; результаты представить в табл. 1
- размер (диаметр) измеряют линейкой в миллиметрах: мельчайшие, точечные, крупноточечные — менее 1 мм;
- цвет колоний и субстрата под колониями (от белого до черного);
- форма — бывает круглая, овальная и т.д.
- край — при необходимости устанавливают с помощью лупы (рис. 10);
- поверхность — бывает гладкая, зернистая, морщинистая, концентрически или радиально исчерченная, бугристая, мучнистая, матовая, блестящая, влажная, сухая и др.;
- прозрачность — бывает прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная;
- структура колонии — бывает однородная, мелкозернистая, волокнистая и др.;
- профиль — бывает изогнутый, каплевидный, плоский, выпуклый, вогнутый;
- консистенция (определяют при касании поверхности колонии бактериальной петлей) — бывает плотная, мягкая, тягучая, тестообразная и др.
На рис. 11 представлены фотографии различных бактериальных колоний
Рис 10. Края колоний
Колонии, различающиеся хотя бы одним из внешних признаков, следует рассматривать как разные типы. Каждый вид бактерий имеет вполне определенный тип колонии, поэтому по числу типов колоний в чашках Петри можно ориентировочно судить о I разнообразии видового состава бактериальной флоры исследуемого пищевого продукта.
2. Определить форму бактерий пяти колоний и спорообразование клеток. Приготовить препараты бактерий, провести простую окраску и их микроскопическое исследование. Результаты записать в табл. 2 и схематично зарисовать.
На рис. 12 представлены фотографии цикла развития бактерий от споры до споры.
3. Определить подвижность бактерий. Приготовить препарат «висячая капля».
Движение бактериальных клеток лучше наблюдать в препарате «висячая капля», используя молодые бульонные или агаровые культуры в возрасте 6-12 ч, но не старше суточных. При наблюдении под микроскопом в поле зрения хорошо видно активное перемещение клеток в разных направлениях с разной скоростью. В отличие от самостоятельного движения клеток броуновское движение взвешенных частиц и неподвижных клеток характеризуется беспорядочными колебаниями на одном месте. Результаты записать в табл. 2.
4. Посеять культуры бактерий на скошенный агар. Сделать пересев культур бактерий со среды на чашках Петри в пробирки со скошенным агаром. Посевы поставить в термостат при температуре 30 °С на 24 ч.
Рис 11. Колонии бактерий (фотографии).
Таблица 1
Культуральные признаки колоний бактерий
Описываемые признаки колоний
Номер колонии
1
2
3
4
5
Цвет
Форма
Край
Поверхность
Прозрачность
Структура
Профиль
Консистенция
Размер
Таблица 2
Форма клеток, образование спор и подвижность
Номер колонии
Форма клеток
Взаимное расположение клеток
Спорообразование
Подвижность
